LCGC en francais - June 2008 - (Page 16)

PROBLEMES TECHNIQUES EN LC Ajustement du Débit et Conformité du Système John W. Dolan, LC Resources, Walnut Creek, California, USA. De quelle façon le débit affecte-t-il la séparation? J’ai reçu récemment une question d’un lecteur concernant l’impact d’un changement de débit sur une méthode validée. La méthode développée pour l’analyse d’un produit multivitaminé utilisait un gradient en chromatographie liquide (LC) à polarité de phases inversée. Elle durait 35 min à 0,7 mL/min. Le lecteur avait observé de faibles changements inter-colonne pendant les quelques années d’utilisation de la méthode, mais le principal problème était que les temps de rétention avaient tous augmenté récemment. Une augmentation du débit à 0,8–0,85 mL/min avait permis d’ajuster les temps de rétention pour atteindre ceux spécifiés dans les paramètres de conformité du système. Le problème était de savoir quelle variation dans le débit était tolérée (les variations de débit n’ayant pas été étudiées durant la phase de validation de la méthode) et quelle pouvait être la principale cause du problème. La rubrique «Problèmes techniques LC» de ce mois sera consacrée aux possibles raisons de la variation des temps de migration. Si la source du problème peut être identifiée et corrigée alors aucun changement de débit ne sera nécessaire. Après nous être assurés de la fiabilité du système, nous nous intéresserons à l’influence du débit et aux changements autorisés, spécialement pour les méthodes en gradient. Variations possibles de la méthode J’aime m’attaquer aux problèmes de chromatographie liquide en les décomposant selon la méthode du «divide-and-conquer». Une des questions les plus courantes quand les problèmes surviennent est de savoir s’ils sont liés à 16 une variation de la méthode ou de l’appareillage chromatographique. Dans chacune de ces deux catégories, il y a plusieurs causes de problème possibles. J’en ai cité quelques-unes dans le Tableau 1, et je suis sûr que d’autres sources de problèmes existent. Regardons d’abord les changements potentiels dans la méthode, puis ceux dans l’instrumentation. Ainsi que le montre le Tableau 1, les causes les plus probables des différences observées dans les temps de rétention suite à des changements dans la méthode sont les variations de la composition de la phase mobile, de la chimie de la colonne ou de la température de la colonne. Nous allons regarder ces paramètres un peu plus en détail par la suite. Les changements de composition de la phase mobile sont une source potentielle de variation des temps de rétention évidente. Faites d’abord les vérifications simples — je remplacerais la phase mobile par une nouvelle. Faites spécialement attention si le solvant A (phase aqueuse) ou le solvant B (phase organique) est un mélange (par exemple, 5% d’acétonitrile dans l’eau pour A et 5% d’eau dans l’acétonitrile pour B). Les tampons peuvent être spécialement problématiques s’ils ne sont pas préparés correctement. Certaines méthodes sont très sensibles à de faibles variations du pH du tampon. Ceci aurait dû être vu lors du développement et de la validation de la méthode ou lors de l’utilisation en routine. Le tampon doit être utilisé dans sa zone tampon ( 1 unité de pH autour du pKa), à une concentration suffisante (généralement une concentration de 10–20 mM est adaptée), et le pH doit être ajusté avant l’ajout de solvant organique. Si une nouvelle phase mobile ne résout pas le problème, regardez la colonne. Variations de la chimie de la colonne: Les changements dans la chimie des colonnes sont bien moins fréquents avec les colonnes à base de silice de haute pureté d’aujourd’hui (également appelée silice deType-B ) qu’avec les colonnes de plus faible pureté (Type-A) qui étaient les plus répandues il y a encore 20 ans. Cependant, quel que soit le soin apporté à la production pour minimiser les variations inter-colonnes, on dirait que les utilisateurs ont toujours le composé particulier qui va révéler les différences minimes entre les colonnes. Pour les méthodes en cours, la façon la plus simple de vérifier les changements dans la chimie de la colonne est de remplacer la colonne par une nouvelle. Vous pouvez vérifier les variations d’un lot à l’autre en commandant des colonnes provenant de lots différents. Si Tableau 1: Paramètres qui affectent les temps de rétention en LC. Changements dans la méthode Composition de la phase mobile Altération de la colonne Température Instrumentation Fuites Bulles dans la pompe Joint de pompe défectueux Clapets défectueux Erreurs de composition de phase mobile Contrôleur de débit défectueux LC•GC en français juin 2008

Table des matières de la publication LCGC en francais - June 2008

LCGC en francais - Juin 2008
Table des matières
De l’éditrice
Introduction de l’AfSep
Performances Comparées de Différents Supports Polairesen vue de l’Analyse d’Herbicides Organophosphorés par Chromatograhie d’Interactions Hydrophiles
Problemes Techniques en LC
Connexions en CPG
Corrélation de Cinq Tests Généraux Représentée par ACP et CAH pour la Caractérisation des Phases Stationnaires de CLPI
Caractérisation de Polymères Sous Forme d’Étoiles Chimiques par Électrophorèse Capillaire
Revue de Forum LABO & Biotech 2008
Produits

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